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生化酶讲义

第4章酶的主要内容:介绍酶的概念、作用特点、分类和命名,讨论酶的结构特点和催化功能,以及酶的作用机理,然后讨论影响酶的主要诱因酶的作用。酶工程的一般介绍和酶的应用。思维?第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 酶的概念和功能特征 酶的名称和分类 酶的诱导机制 酶的活性调节 酶工程导论 第一章 酶的概念及其功能特性 1. 酶的概念的发展酶和生物催化剂 二、 酶的性质具有催化效率极高、特异性高、易于灭活和可调的特性。一些酶需要辅因子 三、 酶 特异性类型 四、 酶的物理性质。酶和生物催化剂概念的发展。蛋白质类:酶克隆酶类、转基因酶类、蛋白质工程新酶类(天然酶类、生物工程酶类)、生物催化剂、核酸类:核酶;脱氧核酶类似物生物催化剂... 酶专一性`类型1结构专一性概念:酶对其催化的分子(底物)化学结构的特殊要求和选择类别:绝对专一性和相对专一性2立体异构专一性概念:酶不仅对底物分子的物理结构有要求,但对其立体异构也有一定的要求。分类:光学异构专一性和几何异构专一性 绝对专一性和相对专一性和绝对专一性 有些酶对底物的物理结构要求非常严格,只作用于一种底物生物化学酶课件,不作用于其他任何物质。

相对特异性 某些酶对底物物理结构的要求比上述绝对特异性略低。它们可以作用于一类化合物或化学键。 1) 键专一性 有些酶只作用于某些键,对键两端的侧链没有严格要求。 2) 基团特异性 其他酶除了作用于某些键外,对键两端的侧链也有一定的要求,往往对其中一个羧基要求严格,对其他官能团要求不那么严格消化道中几种蛋白酶的特异性。消化道蛋白酶作用的特定酶的物理性质 1. 大多数酶是蛋白质(大多数酶是蛋白质) 日本萨姆纳脲酶于1926年结晶,并强调酶是蛋白质。 1930年,诺斯罗普等人。获得了胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的结晶,进一步证明酶是蛋白质。 . 1980年代,J.B.Sumner、J.H.Northrop发现一些RNAs具有催化活性,甚至一些DNAs具有催化活性,极大地冲击了传统的酶作为蛋白质的概念。 2.一些RNAs具有催化活性。 1982 年,T. Cech 等人。发现四膜虫的 rRNA 前体可以在没有蛋白质的情况下自行加工。他们发现RNA具有催化活性。托马斯切赫科罗拉多大学博尔德,美国 1983 日本 S.Altman 等。研究了RNaseP(由20%的蛋白质和80%的RNA组成),发现RNaseP中的RNA可以催化大肠杆菌tRNA前体的加工。

Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USACech 和 Altman 独立发现了 RNA 的催化活性,并将这种酶命名为核酶(ribozyme)。两人获得1989年诺贝尔化学奖。酶的种类 简单的蛋白酶按酶分子的组成分类,结合蛋白酶、酶、蛋白质金属离子、辅因子、金属离子、小分子、有机单体酶,按酶的特性分类为蛋白质、寡聚酶,多酶复合物,第二节,酶命名和分类(略)一、 Nomenclature:习惯命名法;系统命名法 二、 国际系统分类和编号 *国际生物化学学会的酶学委员会将酶分为六类:1. 氧还原酶、2. 转移酶、3. 水解酶、4. 裂合酶、5.异构酶,6. 合成酶* 每种酶都有编号,如醇脱氢酶EC 1. 大类1. 子类1. 子类27 编号第三节酶机理一、 酶催化中间产物理论二、 ]酶的活性中心和必不可少的功能基团三、酶的动作特异性机制四、主要诱因与酶的高效率有关。酶催化的中间产物理论 → E + S ← ES k 1k1 酶(E)和底物(S)结合形成不稳定的中间体(ES)),然后分解为产物(P)并释放酶,使反应沿着低活化能路径进行,降低反应所需的活化能,从而提高反应速率。

能级→k2ΔE1P + EESΔE2E+SΔGP+ E 反应过程 His 119His 12 Lys 41RNase-substrate complex 酶作用的具体机制 Lock and key theory: 酶的活性中心比作钥匙孔生物化学酶课件,底物分子为就像一把钥匙,底部的物质可以专门插入酶的活性中心。诱导拟合理论:酶的活性中心在结构上是灵活的。当底物靠近活性中心时,可诱导酶蛋白的构型发生变化,使酶活性中心的相关官能团正确排列定向,使其与底物互补的有机结合的形状催化反应的进程。酶特异性“锁钥理论” 酶特异性“诱导契合理论”羧肽酶与底物结合前后的构象变化 Glu270ZnTyr248 Arg145Zn 底物 四、 与酶的高效率相关的主要诱因 1、 Proximity和取向效应 2、 诱导拟合和底物变形修饰 3、 共价催化 4、 酸碱催化 5、 微环境影响 例:糜蛋白酶可作为亲核官能团和酶分子中的酸碱催化作用官能团Ser195 His57 Asp102102Asp His57A。酶分子Ser195 102AspSer195Ser195中的电荷中继网络底物His57His57 Asp102胰凝乳蛋白酶分子处于催化三联体构型B。添加底物后,将质子从Ser转移到His上,带正电荷的咪唑基由带负电的 Asp 静电相互作用稳定。胰凝乳蛋白酶反应的详细机理(1)底物与底物结合产生共价ES复合物His57质子供体CN键破坏胰凝乳蛋白酶反应的详细机理(2)羰基产物放水,亲核电击中四面体)中间体,破坏甲基产物,释放酶的活性中心和必需的官能团,直接与酶分子中的底物结合,与酶催化直接相关的区域称为酶的活性中心或活性位点。形成酶活性中心和维持酶特定氢键所必需的官能团是酶分子所必需的官能团。

示例;糜蛋白酶(chymotrypsin)羧肽酶(核糖核酸酶)糜蛋白酶活性中心SerHisAsp活性中心重要官能团:His57、Asp102、Ser195为Tyr 248为Arg 145为Glu 270为底物锌羧化酶影响活性中心部分示意图酶促反应速率(enzymatic reaction kinetics)一、 酶促反应速率和酶活性单位的测定二、 影响酶促反应速率的诱因 测定和酶活性单位1、 酶促反应速率初速测定的概念2、 酶活性检查酶的浓度和存在。很难直接表达酶的“数量”(质量、体积、浓度)。通常用酶催化特定反应的能力来表示酶的量,即酶的活性。酶催化某种化学反应的能力称为酶活性,它一般由酶在最佳条件下催化化学反应的速率决定。 3、 酶活性表达 4、 酶活性测定方法:终点法 动力学法 酶活性测定法 终点法:酶反应经过一定时间后停止,然后得到产物或反应物的量用物理或化学方法测得的变化。动力学法:连续测量反应过程中产物\底物或辅酶的变化,直接测定酶反应的初速度。酶活性的表达 活性单位(active unit)衡量酶催化能力的大小。惯用单位(U):底物(或产物)变化/单位时间国际单位(IU):1μmoL变化/分钟 Katal(Kat):1moL变化/秒比活(比活)比活=总蛋白mg总活度单位测量酶含量 = U(或 IU)mg 蛋白质转化系数(Kcat) 测量转化效率 每秒底物(μmol) 酶每秒 影响酶反应速率的分子 1、 酶含量 当 S 足够过量时,其他条件固定,有不是不利的诱因,v = k [E] 2、底物含量3、 pH(最佳pH的概念)4、温度(最佳水温的概念)5、活化剂6、抑制剂的作用底物含量对酶反应速率的影响 1、 酶反应速率与底物含量的关系曲线(Michaelis-Menten 曲线) 2、 米氏方程的提出和推论 3、 米氏常数的含义 4、 测定的e 米氏常数 单分子酶促反应米氏方程和 Km → E + S ← ES k 2 → kk11P+E 米氏方程:V max [S] v = K m + [S] 米氏常数:Kmk 1 + k 2 = k1 推理原理:从酶被底物饱和的现象出发,根据“稳态平衡”假说的概念进行推理。

酶反应初速度的概念 [P] 斜率=[P]/t = V(初速度) t 酶反应速度与底物含量关系曲线 [S ]S +E[Et] [ES] k1 → ←1 kES[ES] → P + Ek2[ES] 生成率:v1 = k1 ([Et] [ES ])[S],[ES] 分解率:v2 = k 1 [ES] + k2 [ES] Michaelis 方程的推导 当酶反应体系处于恒定状态时: v1 为: 令: k1 ([Et] [ES ])[S] = k1 [ES] + k2 [ES] k 1 + k2 = Km k1[Et ][S] [ES ][S] = k1 + k2 [ES] k1 然后: K m [ES] + [ES ][S] = [E t ][S ]= v2 → 完成后: [ES] =[Et ][S] K m + [S ](1) 由于酶促反应速率由[ES]决定,即v = k2 [ES],[ES] = Substitute (2) 转化为 (1) 得到:当 [Et]=[ES], [Et ][S] v = k2 K m + [S] 所以 → v=k2 [Et ][S] (3) K m + [S ]v k2(2)v = Vm Substitute (4) 变成 (3), 那么:Vmax [S] v = K m + [S ]Vm = k2 [Et ](4) 的意思常数*当当v = Vmax / 2时,Km = [S](Km的单位为含量uni t) * 是酶在一定条件下的特征化学常数。通过测量Km值可以区分酶。

* 大约代表酶和底物的亲和力。 Km 越小,E 对 S 的亲和力越大,Km 越大,E 对 S 的亲和力越小。 *当 Km 已知时,Mie 方程可用于估计任意 [s] 处的 v,或 [s] 下任何 v.(用 Km 的倍数表示) 练习题:已知酶的 Km 值为 0.05mol.L-1,底物的含量应为该酶催化的反应速率时酶达到最大反应速率的80% 多少?米氏常数确定的基本原理:将米氏方程化为等价于y=ax+b的线性多项式,然后用绘图法求Km。示例:双倒数映射法(Lineweaver-Burk 法) Mie 方程的双倒数法:1 Km 1 1 — = ——。 — + ——V Vmax [S] Vmax 酶动力学 pH 对的双倒数图 酶反应速率的影响 v 过酸过碱引起酶蛋白变性,影响底物分子的解离状态,影响酶的解离状态分子,影响酶活性中心的构型,最适pH,pH温度与酶反应速率的关系,达到最适水温;随着温度的下降,反应速率促使酶成为蛋白质,其随着温度的升高,变性率也会促进酶的生长。最佳水温不是一个固定的常数。 v 温度激活剂对酶作用的影响。任何能增强酶活性的物质,称为酶激活剂型金属离子:K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+ 阴离子:Cl-、Br 有机分子:还原剂:抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金属螯合剂:EDTA 抑制剂对酶作用的影响。凡是改变酶的必要官能团或酶活性部位基团的化学性质,使酶活性降低甚至完全丧失酶活性的,都称为酶的抑制剂。 (抑制剂)。

类型:不可逆抑制剂 可逆抑制剂 应用:开发杀虫剂和药物,研究酶的作用机制,确定代谢途径抑制剂、非特异性不可逆抑制剂、不可逆抑制剂、特异性不可逆抑制剂竞争E+S+的种类和特征IESP + E示例:磺胺类抗生素H2N-SO2NH2 H2N-COOHEI的药物机理苯甲酸丁酸非竞争性抑制作用+ IE + SES + IP + EEI + SESI示例:重金属离子(Cu2 +,Hg2 +,Ag +,Pb2 +)金属络合剂(EDTA, F-, CN-, N3-) 竞争性非竞争性底物与酶特异性结合的抑制作用机制示意图 竞争性抑制 非竞争性抑制 竞争性抑制曲线 非竞争性抑制曲线 非特异性不可逆抑制剂 An抑制剂作用于一个或多个酶分子类的官能团,这些基团含有必要的官能团,t导致酶失活。类型:特定的不可逆抑制剂。这些抑制剂的选择性太大。它们只能与酶活性中心的单个官能团不可逆地特异性结合,导致酶活性丧失。示例:有机磷杀虫剂 OR XPO -Ser-OH OR OR -Ser-O PO OR 有机汞化合物抑制酶活性 示例:有机砷抑制羟化酶 SH SH 巯基化酶 E+ Hg2+ES S Hg2+ + 2H 巯基活性丧失酶。存在或不存在抑制剂时酶促反应的动力学方程。类型公式 VmaxVmaxKm Km 在没有抑制剂的情况下降低(正常) Vmax[S] v = Km +[S] Vmax[S] v = [I] + [S] Km (1+) Ki] [Vmax / 1+ [I] ) [S] (Ki v = Km+[S] [Vmax (1+ [I] )[S]] / Ki v = [I] ] +[S] [Km / (1+) Ki 竞争性抑制剂保持不变,非-竞争性抑制剂降低不变,抗竞争性抑制剂降低,降低对第五节酶活性的调节一、变构酶和酶变构(变构)效应2.酶的共价调节和酶的物理修饰三、各种酶的分子方法。同工酶(isoenzyme)四、 酶原激活酶的变构(allosteric)效应 概念:除了某些酶分子表面的活性中心外,还有调节剂特异性结合位点称为调节位点(或变构位点)。调节剂与调节位点的结合导致酶的氢键发生变化。,导致酶活性增加或增加,th这种现象称为变构效应(allosteric effect),具有上述特性的酶称为变构酶(allosteric enzyme)。

例:安门冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)变构酶活性调控机制:序列变化模型和变构模型酶变构(变构)效应示意图效应物变构中心活性中心a-非调节酶b-正协同变构酶S-变构酶与米氏酶动力学曲线对比 1-非调节性酶 2-正协同变构酶 3-负协同变构酶如何区分米氏酶和变构酶?当酶与底物(配体)结合达到 90% 饱和度时,Koshland 建议使用饱和比 (Rs)。底物含量 Rs = 当酶与底物(配体)结合至 10% 饱和度时的底物。米氏酶的典型含量 RS=81 具有正协同效应的变构酶 RS81ATCase 的结构及其催化链的变构过度作用 CC CCATP(正效应子) CTP(负效应子) CR RC CR RR RR RRRR RC CCC C Non - 催化活性官能团(T型)和催化活性官能团(R型)变构酶序列变化模型 SSSS SSS S SSS SSS SSS亚基均在R型亚基均在T型序列变化别构酶 统一模型 T 状态(对称亚基) SSSS SSS S SSS SS ST 状态(对称亚基) 对称亚基一致变化。对称亚基酶的共价修饰。单独的酶可以通过其他酶在其多肽链上执行单独的官能团。可逆共价修饰使其处于活性和非活性的相互转换状态,从而调节酶活性。

此类酶称为共价修饰酶。目前已经发现数百种酶在翻译后必须进行共价修饰,其中一些酶处于分支代谢途径,成为调控代谢流的关键酶或限速酶。 AEa-bBCEc-d D Ec-g GFP1 关键酶(限速酶)HP2 因为这些调节的生理意义广泛,反应灵敏,节能,机制多样,在体内变得非常灵活,经常受到影响通过激素甚至神经。命令导致级联放大反应,因此它们变得更加引人注目。蛋白质的磷酸化和去磷酸化 1 型:Ser/Thr 2 型:Tyr 型 ATP 蛋白激酶 ADP 蛋白 nP 蛋白蛋白磷酸酶 nPi 1 型:Ser/Thr 型 2 型:Tyr 型 3 型:双底物型 H2O 反应型修饰的氨基酸残基 Tyr、Ser、Thr.His 腺苷酸化反应的共价修饰 S-腺苷-高磷酸化 TyrTyrS-腺苷-Met 甲基化 CysGlu 级联系统调节糖原分解示意图 肾上腺素或胰高血糖素腺苷酸环化酶(活性)肾上腺素或(非常微量)胰高血糖素 1 21、 腺苷酸环 酶的含义(无活性):由于酶的共价修饰反应是酶促反应,只要存在少量信号分子(如激素),这些酶促反应可以被加速,并且可以对大量其他酶进行物理修饰以获得放大效果。

这种调整方法快速且极其有效。 2、 ATPcAMP×1023 3、蛋白激酶(无活性)ATPR-cAMP蛋白激酶(有活性)4、磷酸化酶激酶(无活性)ADP4×1045磷酸化酶激酶(有活性)ATP ADP 5、磷酸淀粉酶b(无活性)× 1066磷酸化酶a(有活性)×108葡萄糖(大量)6、糖原1-磷酸葡萄糖血压葡萄糖6-磷酸葡萄糖苷酶各种分子方法-同工酶概念:存在于同一属或不同物种,不同物种中的一组酶同一个体或同一组织、同一细胞的组织,具有不同的分子方法但能催化相同的化学反应,称为同工酶类:初级同工酶;二级同工酶实例:乳酸脱氢酶研究意义:作为遗传标记;作为临床诊断指标;研究一些代谢调控机制,乳酸脱氢酶催化化学反应COOH CH(OH) CH3+ NAD+乳酸脱氢酶COOH C—O CH3+NADH+H+乳酸丙酮酸乳酸脱氢酶同工酶产生示意图结构基因mRNA多肽亚基ab乳酸脱氢酶同工酶电泳图斑点线M4 M3H M2H2 MH3聚集H4 +不同组织中LDH同工酶的电泳图谱LDH1(H 4) LDH2(H3M)LDH3(H2M 2) LDH4(HM 3) LDH5(M 4)) ,骨骼肌血清+-原始酶原激活体内处于非活性状态的酶前体(酶原)在某些条件下被修饰成为活性酶的过程称为酶原激活。

本质是对酶原进行修饰以产生正确的分子构象和活性中心。可见,酶分子的特定结构和酶活性中心的产生是酶分子催化活性的基本保证。示例:胰蛋白酶原的激活。肠激酶六肽。活性中心胰蛋白酶原活化示意图。第六节将酶学与工程学相结合,开创了酶工程的新领域。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术,酶分子结构的修饰与重构,及其在工农业、医药卫生和理论研究中的应用。酶工程导论 一、 化学酶工程 天然酶固定化酶 化学修饰酶 人工模拟酶 二、 生物酶工程 克隆酶 突变酶 新型酶固定化酶 水溶性酶经过化学或物理处理,固定在聚合物上成为不溶于水但在支持物(或载体)上仍具有酶活性的酶制剂形式,称为固定化酶。吸附法、包埋法、共价偶联法、交联法、溴氰基亚氨基碳酸酯基偶联法、OH OH(聚烷基载体)BrCNO-C-N OH H2O(活性)O OC=NHO-CONH2(惰性)OHH2N-EOH O -CO-NH-E OH OOC=NE OC-NH-E NH戊二醛交联法OHC(CH2)3CHO戊二醛H2N-E-HC=NEN=CH(CH2) 3-CH=N-EN) CH N CH酶整修和模拟酶整修:功能官能团物理修饰、酶蛋白基团物理修饰、酶物理修饰、分子内或分子间交联反应、酶模拟:根据酶作用原理模拟活性结合酶的中心和催化机理,采用物理方法制备结构简单、高效、选择性高、稳定性好的新型催化剂,可以是无机化合物、有机化合物或小分子肽。

人工模拟酶β-酶催化侧链环状寡糖分子结构。环糊精环糊精结构模型催化支链与环糊精连接,可模拟糜蛋白酶生物酶工程示意图。酶蛋白的基因设计 结构、功能、新酶、新蓝图、分子蓝图、选择性修饰方案、DNA重组技术、新酶克隆、酶效用开发、突变酶基因修饰、DNA重组技术、酶基因产物问答1、有哪些因素会影响酶促反应?它们如何影响? 2、 尝试比较酶的竞争性和非竞争性抑制的优缺点。 3、 米氏方程是什么,米氏常数 Km 的含义是什么?试求酶反应速率达到最大反应速率的99%时所需的底物含量(单位为Km)。 4、 什么是同工酶?为什么我可以使用电泳分离同工酶?同工酶在科学研究和实践中有哪些应用? 5、 说明酶结构和功能之间的相互关系。 6、 称取某蛋白酶制剂25mg,制成碱液25ml,以酪蛋白为底物,取出该酶溶液1ml,用福林-苯酚比色法测定酶活性。已知每小时酸形成 1500 微克酪氨酸。另取2ml酶液,用凯氏定氮法测定蛋白氮为0.2mg。若以每分钟形成1微克酪氨酸的酶量为活性单位,根据上述数据,求出富含(1)1ml酶液的蛋白质数和酶活性单位数) ;(2)酶制剂的比活性;(3)1克酶制剂的总蛋白浓度和酶活性单位数。名词解释活性中心全酶酶原活性单位比活性米氏方程Km诱导契合变构效应核酶辅酶和辅基固定酶

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